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抑郁障碍
抑郁症患者肠道菌群丰度和种类及基因功能通路的病例对照研究
中华精神科杂志, 2017,50(03): 208-213. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-7884.2017.03.010
摘要
目的

探讨抑郁症患者的肠道菌群丰度和种类及基因功能通路情况。

方法

采用鸟枪法宏基因组测序方法,对18例抑郁症患者(抑郁症组)及24名健康对照者(对照组)的肠道菌群丰度和种类及基因功能通路情况进行分析。

结果

抑郁症和对照组在菌群丰度上差异无统计学意义(t=0.33,P=0.74),而在细菌种类水平上差异有统计学意义(t=-4.37,P<0.01)。氨基酸球菌属、发酵型氨基酸球菌、发酵氨基酸球菌DSM20731、糖解梭菌WM1、瘤胃菌属、嗜中温螺旋杆菌为抑郁症组较对照组表达较多的6种细菌(F=19.50、15.50、26.46、26.72、13.57、14.59,均P<0.01),而嗜二氧化碳噬细胞菌、绿色糖单孢菌、猫螺杆菌ATCC_49179为抑郁症组较对照组表达较少的3种细菌(F=19.95、12.66、69.52,均P<0.01)。2组在菌群基因的功能通路上差异有统计学意义(均P<0.01),抑郁症组较对照组表达较高的2种通路为泛酸酯和辅酶A合成、色氨酸代谢通路(F=12.84、10.46),抑郁症组较对照组表达较低的通路为P53信号通路(F=13.35)。

结论

抑郁症患者肠道菌群的表达失调,这可能与泛酸酯和辅酶A合成、色氨酸代谢、P53信号通路表达差异有关,提示肠道菌群种类的表达失调可能参与了抑郁症的发病。

引用本文: 荣晗, 徐丹, 刘铁榜, 等.  抑郁症患者肠道菌群丰度和种类及基因功能通路的病例对照研究 [J]. 中华精神科杂志,2017,50( 3 ): 208-213. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-7884.2017.03.010
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抑郁症的发病机制至今仍不明确,既往相关假说主要集中在神经内分泌系统中的下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic pituitary adrenal axis, HPA)轴、单胺类神经递质及受体、神经营养因子、细胞因子学说等[1]。已有研究表明,应激可通过调节HPA轴从而影响机体神经递质及受体、神经营养因子以及细胞因子的表达水平[2]。2013年Dinan和Cryan[3]研究显示,肠道微生物可以调控HPA轴、细胞因子以及单胺类神经递质。此外,补充益生菌可以改善抑郁模型大鼠的抑郁行为[4],提示肠道微生物可能与抑郁症的发病密切相关。宏基因组是指微生物群落中的所有基因组的集合[5],目前主要针对细菌的研究。鸟枪法是指将完整的DNA片段处理成若干小的片段,再把这些片段连接起来的测序方法[6],常用于宏基因组的研究。为全面了解抑郁症患者的肠道菌群状况,我们通过鸟枪法宏基因组测序方法,对复发性抑郁症患者及健康对照者的肠道菌群进行分析,现报道如下。

资料和方法
一、对象

抑郁症组:选取自2015年1月至2016年1月在深圳市康宁医院就诊的门诊及住院的患者。入组标准:(1)符合ICD-10和DSM-5中抑郁症的诊断标准;(2)年龄30~65岁,发作次数≥2次;(3)17项汉密尔顿抑郁量表(17-items Hamilton Depression Scale,HAMD17)>17分;(4)小学以上文化;(5)18.5<体质量指数(body mass index, BMI)<24;(6)2周内未曾应用抗生素和微生态制剂。排除标准:(1)合并躯体疾病及脑器质性疾病者;(2)合并轴Ⅰ、轴Ⅱ其他任何精神障碍、人格障碍及物质滥用/依赖者;(3)近2周内曾使用任何抗抑郁药及抗精神病药者;(4)近1个月内使用长效抗精神病药或接受改良电休克治疗(modified electronic convulsive therapy,MECT);(5)妊娠及哺乳期妇女;(6)近1周内存在应激事件;(7)有内分泌疾病病史。

对照组:选取同期深圳市康宁医院周边社区健康志愿者。入组标准:(1)年龄30~65岁;(2)小学以上文化;(3)18.5<BMI<24;(4)2周内未曾应用抗生素和微生态制剂。排除标准:(1)近1周内有应激事件者;(2)妊娠及哺乳期妇女。

本研究通过深圳市康宁医院伦理委员会审查(批号:2014年伦审第01号)。所有纳入研究对象均自愿签署知情同意书,测试前告知被试者及监护人试验目的及测试内容。

二、方法

1.依据《健康及饮食习惯调查问卷》调查[7],收集抑郁症组和对照组的饮食习惯情况并进行比较。

2.粪便采集与DNA提取:门诊及住院患者入组后24 h内完成样本采集。粪便收集在一个无菌塑料盒中,容量为30 ml,带有旋转盖子,收集大便约15 g,编号登记后随即放入-80 ℃冰箱保存。对照组粪便收集则在门诊体检完成后,处理同抑郁症组。所有粪便标本收集完成后采用粪便DNA提取试剂盒(StoolGen DNA kit,北京康为世纪生物科技有限公司)进行DNA提取。

3.宏基因组建库和鸟枪法宏基因组测序:取2 μl DNA样品应用试剂盒(Qubit dsDNA BR assay kit,美国赛默飞世尔公司)进行DNA浓度定量。文库(插入大小为200~500 bp)应用Truseq DNA建库试剂盒(美国Illumina公司生产),该试剂盒连接在自动化SPRI工作站(美国贝克曼库尔特公司生产)。每个文库构建完成后,采用Agilent 2100生物分析仪(美国安捷伦科技公司生产)按照试剂盒说明书进行质量控制。通过质量控制后,即文库浓度>3 ng/µl,应用Illumina HiSeq 2500测序平台(150 bp,双端测序,美国加州圣地亚哥Illumina公司提供)进行深度测序,每个样本测序数据1 G以上。

4.菌群分类和基因功能注释:首先,过滤掉一些质量差或含有接头的序列。其次,所有测定的序列均对照人类参考基因组Hg19以剔除人为污染的序列。再次,采用最新的MEGAN软件[6](即MEGAN5)对鸟枪法宏基因组数据进行菌群分类及基因功能分析。最后,分类分析和基因功能注释结果应用KEGG[7]和eggNOG数据库[8]进一步功能注释,得到的菌种和基因功能通路等数据用于后续的统计学分析。

5.抑郁症组与对照组菌群丰度和菌群种类及功能通路水平的比较:(1)2组肠道菌群组内和组间的差异比较:采用不同样本标准化后(即均一化为100万条测序序列)的菌种数据,根据Jaccard系数度量2个样本之间的相似性,样本A和B之间的Jaccard系数=(样本A ∩样本B)/(样本A ∪样本B),Jaccard系数值越大,样本相似度越高;根据1-Jaccard系数度量2个样本之间的距离(distance),1-Jaccard系数值越小,即距离越小。(2)2组肠道菌群种类差异的比较:首先对菌种测序数据标准化后(即均一化为100万条测序序列),采用方差分析的方法,将P≤0.05的菌种采用DESeq2计算组间log2(抑郁症组/对照组)差异绝对值≥1的菌种,然后选择样品中菌群平均表达量≥100的菌种,最后将这些菌种绘制热图。(3)2组肠道细菌功能通路水平差异的比较:利用KEGG数据库对基因进行功能注释后,选取第3级的功能通路(kegg pathway level 3)的数据,先标准化后(即均一化为100万条测序序列),然后进行方差分析,将差异有统计学意义(P ≤0.05)的通路绘制热图。

三、统计学处理

所有数据均采用SPSS 20.0进行统计学分析,2组一般人口学资料及饮食习惯数据计数资料比较采用卡方检验,计量资料比较采用独立样本t检验,检验标准为α<0.05。通过鸟枪法宏基因组测序得到的数据,菌群丰度和种类进行标准化(即均一化为100万条测序序列)后分别应用R软件进行方差分析和DESeq2[9]计算,2组间比较采用独立t检验。KEGG注释的功能通路得到的数据采用R软件进行方差分析。

结果
一、2组一般资料及饮食习惯情况的比较

抑郁症组:入组18例,其中男10例,女8例,平均年龄(44.7±12.5)岁;BMI为(22.6±3.8);总病程(94.2±65.0)个月;发作次数(5±9)次;受教育年限(12.4±3.3)年。对照组:入组24名,其中男14名,女10名;平均年龄(42.9±10.6)岁;BMI为(21.7±1.5);受教育年限(12.1±2.3)年。2组在年龄(t=0.609,P=0.55)、性别构成比(χ2=0.096,P=0.76)、受教育年限(t=0.33,P=0.75)及BMI(t=-0.43,P=0.67)方面差异均无统计学意义。

抑郁症组与对照组在进食结构、主食量、油腻食物、高胆固醇、红肉、白肉、蔬菜、水果、豆类、奶制品、酸奶、发酵食品、饮水量、汤或粥、茶或咖啡的摄入量差异无统计学意义,结果见表1

表1

抑郁组与对照组饮食习惯情况比较( ± s

表1

抑郁组与对照组饮食习惯情况比较( ± s

项目抑郁症组(n=18)对照组(n=24)χ2自由度P
吃早餐次数(次/周)3.50±0.223.65±0.126.01130.111
饮食口味(清淡/嗜糖/嗜辣/嗜盐,例)15/0/1/211/6/5/28.60030.035
饮食结构(荤素均衡/荤食为主/素食为主/完全素食,例)14/1/3/017/4/3/01.25930.533
午晚餐习惯(例)a11/5/1/112/12/0/04.15330.245
主食结构(例)b15/1/2/020/2/1/11.55630.670
主食摄入量(两/d)2.68±0.182.39±0.155.18430.159
油腻食物量(次/d)10.5±0.051.26±0.093.97210.056
高胆固醇摄入量(份/d)1.23±0.091.48±0.122.65520.265
红肉摄入量(两/d)1.73±0.141.74±0.110.71120.701
白肉摄入量(两/d)1.59±0.171.74±0.114.42630.219
蔬菜摄入量(份/d)2.45±0.172.91±0.184.09140.394
水果摄入量(份/d)3.41±0.303.43±0.292.98250.703
豆食类摄入量(份/d)2.27±1.882.17±0.151.51630.679
奶制品(杯/d)1.91±0.252.83±0.249.26340.055
酸奶摄入量(次/周)3.59±0.163.40±0.188.77330.062
发酵食品摄入量(次/周)3.05±0.192.83±0.163.17430.366
饮水量(ml/d)2.50±0.202.09±0.154.02030.259
汤或粥摄入量(次/周)2.52±0.243.00±0.213.10630.389
茶或咖啡摄入量(次/周)1.68±0.272.30±0.336.70850.243

注:1份高胆固醇食物相当于2个蛋黄或1个乒乓球大小的动物内脏或半个乒乓球大小的动物油脂;1份蔬菜相当于1碗(约250 ml)未经煮熟的蔬菜或1/2碗煮熟的蔬菜、瓜和根茎类或1/2碗煮熟的菇类和豆类;1份水果相当于1个中型的水果(如橙、苹果、梨)或1/2个大型的水果(如香蕉、西柚及杨桃);1份豆类相当于1/2碗(约250 ml)煮熟的豆类或1块豆腐或1杯豆浆(240 ml);1杯奶相当于240 ml鲜奶酪或乳酪或2片芝士;a午晚餐习惯:每天定时吃午、晚餐/每天都吃午、晚餐,但不定时/每天都定时吃午、晚餐,但一般只吃一餐/每天进食正餐的次数都不同,且不定时;b主食结构:大米为主,少量粗粮薯类/白面为主,少量粗粮薯类/大米白面、粗粮薯类二者基本等量/粗粮、薯类为主,少量大米白面

二、2组菌群丰度及菌群种类比较

通过测序所得菌群丰度及种类,抑郁症组与对照组在菌群丰度上差异无统计学意义(t=0.33,P=0.74),而在菌群种类水平上差异有统计学意义(t=-4.37,P<0.01)。抑郁症组较对照组菌群种类减少。见图1

图1
抑郁症组(n=18)和对照组(n=24)菌群丰度及种类对比图
图1
抑郁症组(n=18)和对照组(n=24)菌群丰度及种类对比图

2组肠道菌群组内和组间的差异比较:Jaccard系数的分析方法显示,抑郁症组和对照组组内肠道菌群相似性较高。抑郁症患者之间肠道菌群相似性高,抑郁症组与对照组之间的距离较大。见图2

图2
抑郁症组与对照组肠道菌群相似性和样本距离分析聚类图

图中红色字母D或N开头的样本为抑郁症组(n=18),紫色字母NLM开头的样本为对照组(n=24)

图2
抑郁症组与对照组肠道菌群相似性和样本距离分析聚类图

2组肠道菌群种类差异的比较:氨基酸球菌、发酵型氨基酸球菌、发酵型氨基酸球菌DSM20731、糖解梭菌WM1、瘤胃菌属、嗜中温螺旋杆菌为抑郁症组较对照组表达较多的6种细菌(F=19.50、15.50、26.46、26.72、13.57、14.59,均P<0.01),而嗜二氧化碳噬细胞菌、绿色糖单孢菌、猫螺杆菌ATCC_49179为抑郁症组较对照组表达较少的3种细菌(F=19.95、12.66、69.52,均P<0.01)。见图3

图3
抑郁症组与对照组肠道内差异有统计学意义的细菌种类热图

图中每行表示差异有统计学意义(P<0.05,方差分析)的菌种;每列表示一个样品,D和N字母开头的为抑郁症组(n=18),NLM字母开头的为对照组(n=24);红色为高表达,蓝色为低表达

图3
抑郁症组与对照组肠道内差异有统计学意义的细菌种类热图
三、2组菌群功能通路水平的比较

抑郁症组与对照组有差异的菌群功能通路中,抑郁症组较对照组表达较高的2种通路为泛酸酯和辅酶A合成、色氨酸代谢通路(F=12.84、10.46,P<0.01),P53信号通路为抑郁症组较对照组表达较低的通路(F=13.35, P<0.01)。见图4

图4
抑郁症组与对照组菌群功能通路差异有统计学意义的热图

图中每行表示不同功能通路,每列表示一个样品,D和N字母开头的为抑郁症组(n=18),NLM字母开头的为对照组(n=24);红色为高表达,蓝色为低表达

图4
抑郁症组与对照组菌群功能通路差异有统计学意义的热图
讨论

我们应用鸟枪法宏基因组测序方法对抑郁症患者与健康对照者的肠道菌群进行研究,相关报道较少。宏基因组学研究常用于肠道微生物的研究,目前应用较多的测序平台为Roche 454 GS FLX Tianium、Illumina HiSeq 2000、SOLiD 5500xl[5]。华大基因的研究中采用Illumina HiSeq 2000测序研究人体肠道菌群与人体健康以及与2型糖尿病的关系[7,8]。宏基因组测序以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库,此测序方法已经相当成熟[9]。本研究中采用Illumina HiSeq 2500进行测序,结果显示抑郁症患者与健康人群肠道微生态菌群结构差异有统计学意义。

本研究结果显示抑郁症组与对照组在菌群丰度上差异无统计学意义,而在菌群种类水平上差异有统计学意义,氨基酸球菌、氨基酸球菌属、发酵型氨基酸球菌在抑郁症组的表达上调。Jiang等[10]采用测定16SRNA这一细菌身份证片段基因的方法测定了30例抑郁症患者肠道微生物的变化,同样发现氨基酸球菌属在抑郁症患者中表达上调。本研究中测定了肠道菌群宏基因组,Jiang等的研究中测定了已知细菌的基因片段,此外在病例选择上,本研究中选取了年龄>30岁的复发性抑郁症患者,尽可能的排除了双相抑郁患者。氨基酸球菌属在2项研究中的表达均上调,提示肠道氨基酸球菌属的表达失调可能参与了抑郁症的发病。氨基酸球菌属主要参与谷氨酸的代谢,而已有众多的研究表明谷氨酸系统与抑郁症发病有关[11],因此氨基酸球菌属在抑郁症患者中表达失调可能与抑郁症患者谷氨酸系统的变化有关,从而与抑郁症发病相关。

本研究结果还表明,瘤胃菌科菌在抑郁症组较对照组明显增加,这与Jiang等[10]的研究结果一致,瘤胃菌科菌属于厚壁菌门,被认为具有抗炎作用[12],其增加可能对抑郁症患者的免疫系统起到调节作用。

本研究显示,与对照组相比,糖解梭菌、嗜中温螺旋杆菌在抑郁症组表达上调,而嗜二氧化碳噬细胞菌、绿色糖单孢菌、猫螺杆菌表达减少,具体机制不明,值得进一步研究。

本研究抑郁症组与对照组差异有统计学意义的功能通路中,色氨酸代谢、泛酸酯和辅酶A合成在抑郁症组的表达高于对照组,而P53信号通路在抑郁症组的表达低于对照组。值得注意的是,抑郁症组肠道菌群色氨酸代谢通路的表达高于对照组。色氨酸作为一种必需氨基酸是5-HT的前体物质,饮食法可以大幅度减低血浆中总色氨酸浓度和游离色氨酸浓度;并且有研究表明,脑内5-羟吲哚乙酸含量减低与血浆色氨酸浓度减低呈正相关[13]。较多研究显示,抑郁症患者所表现的抑郁情绪与体内5-HT含量减低有关,而通过快速色氨酸耗竭试验可诱发50%~60%的缓解期抑郁症患者在服用混合制剂后约5 h出现短暂的抑郁情绪[14,15]。因此我们推测,抑郁症组肠道菌群色氨酸代谢通路的表达增高,可能与抑郁症患者肠道细菌促进色氨酸代谢有关,而肠道色氨酸代谢的改变可能引起脑内5-HT增加,提示与抑郁症发病机制密切相关。

泛酸于1933年被发现是酵母的生长因素,是辅酶A的组成部分,其主要功能是参与体内能量的制造,帮助细胞的形成,维持发育[16]。本研究中抑郁症组肠道菌群泛酸酯和辅酶A合成通路表达增加,机制不明,可能与抑郁症患者肠道菌群对机体的反馈调节有关。

已有研究表明,野生型P53诱导的脱磷酸酶1能够负性调控应激诱导的负性行为,而脱磷酸酶1主要是通过灭活P53来抑制促凋亡因子和促免疫炎性因子的表达[17],而抗抑郁剂氟西汀可以通过下调P53通路抑制白细胞介素-1b诱导的神经元凋亡,因此抑郁症组肠道菌群P53信号通路的表达异常[18],表明肠道细菌可能通过P53信号通路参与抑郁症的发病。

总之,抑郁症患者肠道菌群的丰度与对照者差异无统计学意义,而在菌种和功能通路上有差异,这表明抑郁症患者肠道菌种和功能通路的改变可能影响抑郁症的发病,而改变肠道菌群结构是否有助于抑郁症的治疗,值得进一步深入研究。

参考文献
[1]
RushAJ, TrivediMH, WisniewskiSR, et al. Acute and longer-term outcomes in depressed outpatients requiring one or several treatment steps: a STAR*D report[J]. Am J Psychiatry, 2006,163(11):1905-1917. DOI: 10.1176/ajp.2006.163.11.1905.
[2]
Bangsgaard BendtsenKM, KrychL, SørensenDB, et al. Gut microbiota composition is correlated to grid floor induced stress and behavior in the BALB/c mouse[J]. PLoS One, 2012,7(10):e46231. DOI: 10.1371/journal.pone.0046231.
[3]
DinanTG, CryanJF. Melancholic microbes: a link between gut microbiota and depression[J].Neurogastroenterol Motil, 2013, 25(9):713-719.DOI:10.1111/nmo.12198.
[4]
SavignacHM, KielyB, DinanTG, et al. Bifidobacteria exert strain-specific effects on stress-related behavior and physiology in BALB/c mice[J].Neurogastroenterol Motil, 2014, 26(11):1615-1627.DOI:10.1111/nmo.12427.
[5]
刘莉扬崔鸿飞田埂高通量测序技术在宏基因组学中的应用[J].中国医药生物技术20138(3):196-200.DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.03.008.
[6]
罗春清杨焕明.微生物全基因组鸟枪法测序[J].遗传200224(3):310-314.DOI:10.3321/j.issn:0253-9772.2002.03.021.
[7]
QinJ, LiR, RaesJ, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature, 2010, 464(7285):59-65.DOI:10.1038/nature08821.
[8]
QinJ, LiY, CaiZ, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J].Nature, 2012, 490(7418):55-60.DOI:10.1038/nature11450.
[9]
王红星王玉平郭晓欢.肠道微生物群-大脑轴及其含义[J].中华精神科杂志,2016,49(4):265-269.DOI:10.3760/cma.j.issn.1006-7884.2016.04.014.
[10]
JiangH, LingZ, ZhangY, et al. Altered fecal microbiota composition in patients with major depressive disorder[J]. Brain Behav Immun, 2015, 48:186-194.DOI:10.1016/j.bbi.2015.03.016.
[11]
MorrisG, AndersonG, DeanO, et al. The glutathione system: a new drug target in neuroimmune disorders[J].Mol Neurobiol, 2014, 50(3):1059-1084.DOI:10.1007/s12035-014-8705-x.
[12]
MonkJM, LeppD, ZhangCP, et al. Diets enriched with cranberry beans alter the microbiota and mitigate colitis severity and associated inflammation[J].J Nutr Biochem, 2016, 28:129-139.DOI:10.1016/j.jnutbio.2015.10.014.
[13]
QureshiAR, LindholmB, GarciaE, et al. Tryptophan and its metabolites in patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis and following renal transplantation[J].Nephrol Dial Transplant, 1994, 9(7):791-796.
[14]
肖爱娇韩志芬黄景斌抑郁症大鼠海马5-羟色胺含量及中缝核色氨酸羟化酶-2表达变化的研究[J].中华精神科杂志, 2008, 41(3):180-183.DOI:10.3321/j.issn.1006-7884.2008.03.014.
[15]
Empathic accuracy and oxytocin after tryptophan depletion in adults at risk for depression[J].Psychopharmacology (Berl), 2016, 233(1):111-120.DOI:10.1007/s00213-015-4093-9.
[16]
GuanJ, HacheyM, PuriL, et al. A cross-metathesis approach to novel pantothenamide derivatives[J].Beilstein J Org Chem, 2016, 12:963-968.DOI:10.3762/bjoc.12.95.
[17]
RuanCS, ZhouFH, HeZY, et al. Mice deficient for wild-type p53-induced phosphatase 1 display elevated anxiety- and depression-like behaviors[J].Neuroscience, 2015, 293:12-22. DOI:10.1016/j.neuroscience.2015.02.037.
[18]
ShanH, BianY, ShuZ, et al. Fluoxetine protects against IL-1β-induced neuronal apoptosis via downregulation of p53[J].Neuropharmacology, 2016, 107:68-78.DOI:10.1016/j.neuropharm.2016.03.019.
 
 
关键词
主题词
抑郁症
肠道菌群
宏基因组学
鸟枪法测序